可肥酸-50猪长期饲喂及体内消除规律试验报告

可肥酸-50猪长期饲喂及体内消除规律试验报告

肖霞，张寒，刘为，王志强

（扬州大学兽医学院，江苏扬州225009）

 

摘要：为了检测长期饲喂饲料添加剂可肥酸-50后猪肠道内苯甲酸及其代谢物（马尿酸）的浓度。本研究首先建立了猪小肠内容物中苯甲酸及马尿酸的高效液相色谱（HPLC）检测方法，采用乙酸乙酯作为提取剂，亚铁氰化钾和乙酸锌作为蛋白沉淀剂，提取内容物样品中苯甲酸。采用水、亚铁氰化钾和乙酸锌共同提取猪肠道内容物样品中的马尿酸。猪小肠内容物中苯甲酸检测限和定量限均分别为0.05 μg/g和0.5μg/g，平均回收率为（101.8±2.41）%。小肠内容物中马尿酸的检测限和定量限均分别为0.1μg/g和0.5 μg/g，平均回收率为（89.16±3.35）%。18头1月龄仔猪，随机分为两组，饲料中分别添加苯甲酸5000 mg/kg饲料（对照组）或可肥酸-50 1670 mg/kg饲料（试验组），连续饲养3周。分别于给药后第7、14、21天采集小肠后1/4段的内容物，测定该内容物中苯甲酸及其代谢物马尿酸的含量。在三个时间点测得可肥酸-50组肠道内苯甲酸浓度均高于对照组；在第7、14天测得可肥酸-50组肠道内马尿酸的浓度低于对照组，但在21天时马尿酸浓度高于对照组。

 

关键词：猪；苯甲酸；马尿酸；HPLC；小肠内容物

 

 

1 材料和方法

 

1.1 药品  苯甲酸、马尿酸标准品由Solarbio公司提供，生产批号分别为703B022、309E021，纯度为99.9%；

 

1.2 试剂 甲醇，HPLC级，购自上海麦克林生化技术有限公司；磷酸，HPLC级，购自德国CNW Technologies GmbH；乙酸铵，HPLC级，购自上海沪试实验室器材股份有限公司。其他所用试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂；水为符合《GB/T6682-2008分析实验室用水国家标准》规定的超纯水。

 

1.3 仪器  Agilent-1260型高效液相色谱仪，配有紫外检测器和色谱工作站，购自Agilent Technologies公司；色谱柱为UltimateR XB-C18  柱（4.6 mm× 250 mm，5 µm），购自Agilent Technologies公司；KS-250D超声仪购自宁波科生仪器厂产品；水浴氮吹仪购自Organomation America；Centrifuge 5810R高速冷冻离心机购自Eppendorf。

 

1.4 溶液的配制  准确称取苯甲酸（马尿酸）标准品（0.02g）于10 mL棕色容量瓶中，加入适量甲醇，震荡溶解后定容至刻度，即配成浓度为2000 µg/mL 苯甲酸（马尿酸）标准储备液，分装后置-20℃下保存，有效期6个月；分别取甲醇、0.02%磷酸水作为检测苯甲酸浓度的流动相、取甲醇、乙酸铵溶液作为检测马尿酸浓度的流动相，经孔径 0.22 µm滤膜过滤，超声脱气。流动相现配现用。

 

1.5 肠内容物样品前处理过程

 

1.5.1苯甲酸提取  称取猪小肠后1/4内容物样品（2.00± 0.02）g于50 mL离心管中，加入乙酸乙酯6ml，60℃水浴下超声20 mim，冷却至室温后加入蛋白沉淀剂亚铁氰化钾、乙酸锌各2ml，涡旋1 min，6000×g离心5 min，取上清移至10 mL离心管中。40℃氮吹至干。加入流动相1 mL涡旋5min复溶，溶液经孔径0.22 µm有机滤膜过滤，收集滤液供HPLC检测。

1.5.2 马尿酸提取  称取猪小肠后1/4内容物样品（1.00± 0.02）g于10 mL离心管中，加入水1ml，60℃水浴下超声20 mim，冷却至室温后加入蛋白沉淀剂亚铁氰化钾、乙酸锌各2ml，涡旋1 min，6000×g离心5 min，取上清经孔径0.22 µm有机滤膜过滤，收集滤液供HPLC检测。

1.6 色谱条件优化  色谱柱为UltimateRXB-C18  柱（4.6 mm× 250 mm，5 µm），苯甲酸检测所使用流动相为甲醇：0.02%磷酸水（40∶60，v/v），流速为1 mL/min，柱温为25℃，进样量为10 µL，紫外检测波长为230nm；马尿酸检测使用的流动相为甲醇：乙酸铵溶液（10∶90，v/v），流速为1 mL/min，柱温为25℃，进样量为10 µL，紫外检测波长为230nm。

 

1.7 方法学研究

 

1.7.1 标准曲线和线性范围  精密量取2000 µg/mL 苯甲酸（马尿酸）标准储备液适量，依次用流动相稀释，配置苯甲酸浓度分别为10、5 、1、0.5 、0.1 和0.05 µg/ml标准溶液，经0.22 µm滤膜过滤后，作为待检标准溶液；精密量取2000 µg/mL 苯甲酸（马尿酸）标准储备液适量，依次用流动相稀释成200、100、20、10、2、1µg/mL系列标准工作液，称取空白猪小肠内容物后，再分别加入100 µL上述工作溶液，使样品添加浓度分别为10、5 、1、0.5 、0.1 和0.05 µg/g，另设空白组织对照。以1.5方法处理各样品。以苯甲酸色谱峰面积对应苯甲酸浓度进行线性回归，求出回归方程和相关系数。每个浓度重复3次。

 

1.7.2 检测限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）  取空白肠内容物添加苯甲酸（马尿酸）标准工作液，使得苯甲酸（马尿酸）在空白组织中的浓度分别为0.05、0.1和0.5 µg/g，按1.5组织样品前处理方法处理后，进行HPLC分析。测定基线噪声值，将信噪比（S/N）≥3定为检测限（LOD）；定量限则结合精密度和准确度测定结果确定，以S/N≥10时的添加浓度作为定量限（LOQ）。

 

1.7.3 回收率的测定  将一定浓度的苯甲酸（马尿酸）标准工作液各100 µL加至空白样品中，制得10、5 、1、0.5 和0.1 µg/g 五个浓度的苯甲酸空白添加样品，按1.5组织样品前处理方法处理后，供HPLC分析，测定峰面积。然后与相应标准品加入空白组织处理后样品进样的峰面积进行比较，计算相对添加回收率。每个添加浓度重复3次。

 

1.7.4 准确度和精密度的测定  将一定浓度的苯甲酸（马尿酸）标准工作液各100 µL加至空白组织中，制得10、5 、1、0.5 和0.1 µg/g 五个浓度的苯甲酸（马尿酸）空白组织添加样品，按1.5组织样品前处理方法处理后，供HPLC分析。每个浓度设3个平行（日内），共重复3批（日间）。据此分别求出日内和日间变异系数。

 

1.7.5 数据处理  Agilent-1260型高效液相色谱工作站提取并处理色谱图，数据用SPASS软件进行处理。

 

1.8 动物试验实测方案 18头猪，体重约10kg，如表1随机均分为2组，饲料中分别添加苯甲酸或可肥酸-50，连续饲养3周。试验期间自由饮水和采食。另备三头作为空白组，饲养一周后采样检测。

 

正式实验开始第7、14、21天，每次杀3只猪，分别采集小肠后1/4段的内容物，测定该内容物中苯甲酸及其代谢物（马尿酸）的含量。

 

 

 

2 结果

 

2.1检测方法验证结果

 

2.1.1 色谱结果  在本试验建立的检测条件下，与肠内容物中其他基质组分完全分开，猪肠道内容物中苯甲酸的出峰时间在9.2 min左右，马尿酸的出峰时间在 6.9min左右。

 

2.1.2 线性关系  苯甲酸药物浓度在0.05~10µg/g范围内，药物浓度与峰面积呈良好的线性关系（R2≥0.9995）；马尿酸药物浓度在0.1~20µg/g范围内，药物浓度与峰面积呈良好的线性关系（R2≥0.9995）。

 

2.1.3 检测限和定量限  取信噪比S≥3时的浓度为最低检测限，该方法检测限为0.05µg/g；根据精密度和准确度测定结果，确定方法的定量限为0.5 µg/g。

 

2.1.4 回收率和精密度  苯甲酸（马尿酸）在肠内容物10、5 、1、0.5 和0.1 µg/g五个添加浓度下，其回收率及精密度测定结果见表2。除苯甲酸添加0.05µg/g和马尿酸添加0.1µg/g浓度外，回收率均大于75.57%，日内和日间变异系数分别小于5.93%和9.96%。

 

 

2.2动物实验实测结果

 

在本研究所建立的检测条件与样品处理方法下，测得空白组肠道内苯甲酸浓度为0.68µg/ml，马尿酸浓度低于定量限。对照组与可肥酸-50组中猪肠道内苯甲酸与马尿酸浓度与变异系数检测结果见表3、4。两组实测浓度对比结果见图1、2。在三个时间点测得可肥酸-50组肠道内苯甲酸浓度均高于对照组；在第7、14天测得可肥酸-50组肠道内马尿酸浓度低于对照组，而第21天马尿酸浓度高于对照组。

 

 

 

 

 

 

3 结论

 

在1月龄仔猪饲料中添加1670 mg/kg可肥酸-50，连续饲喂三周，给药后第7、14、21天采集小肠后1/4段的内容物，测得苯甲酸的浓度在三个时间点均高于添加5000 mg/kg苯甲酸（对照组），但差异不显著；在第7天测得可肥酸-50组肠道内马尿酸的浓度低于对照组，但差异不显著，第14天测得可肥酸-50组肠道内马尿酸浓度显著低于对照组，而在21天时小肠内容物中马尿酸的浓度显著高于对照组。

 

— End —